在与癌症这场艰苦的战斗中，我们不仅要面对细胞染色体（chromosomal DNA）中基因的变异，还得警惕癌细胞藏着一个“秘密武器”——游离在外的环状DNA，称之为extrachromosomal DNA (ecDNA)。这些“脱缰”的DNA就像是癌细胞里的“加速器”，能够大量扩增致癌基因（oncogenes），赋予癌细胞超强的生长、适应和逃避治疗的能力，让它们像“打不死的小强”一样难以根除。ecDNA的存在，是许多肿瘤预后不良、治疗耐药的重要原因。

然而，这些没有着丝粒（centromeres）的ecDNA，它们是如何在细胞分裂的混乱中保持稳定，并不断复制和传递的？这其中的分子机制一直是一个充满挑战的谜题。它们会不会给细胞带来什么“麻烦”？细胞又会如何应对这些特殊的DNA分子？

4月28日一项发表在《Cell》上的重磅研究“Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with DNA damage pathway in tumors”，为我们揭开了这个谜底的一部分，而且发现异常惊人！这项研究通过构建含有ecDNA的细胞模型，深入探究了ecDNA的命运。研究人员发现，ecDNA在细胞内的复制和转录活动，竟然会持续地引发DNA损伤——特别是DNA双链断裂（DSBs），进而激活细胞自身的DNA damage response (DDR)（DNA损伤反应）通路。

更令人意想不到的是，ecDNA要想在细胞里长期稳定存在，恰恰需要依赖细胞的DDR通路来修复它自己造成的损伤！尤其是alt-NHEJ（替代性非同源末端连接）这一特殊的DNA修复路径，被证明是ecDNA维护的关键“保镖”。

这种ecDNA与细胞DDR通路之间奇妙的“相爱相杀”关系，彻底颠覆了我们以往的认知，也为对付携带ecDNA的顽固肿瘤提供了全新的视角。这意味着，如果我们能找到方法干扰或破坏ecDNA对DDR的这种“借力”，我们或许就能切断ecDNA的生存线索，从而有效地打击那些最难缠的癌细胞。这项研究不仅揭示了ecDNA复制维护背后的核心机制，更指明了潜在的治疗靶点，为开发全新的抗癌疗法带来了希望曙光。

癌症里的“暗物质”：ecDNA的复制与维持之谜

故事的主角是来自一项利用CRISPR-C技术构建ecDNA模型的突破性研究。CRISPR-C技术就像一把能够精确剪切DNA的分子剪刀，研究人员巧妙地利用它，在人类胶质母细胞瘤来源的U251细胞和人胚胎肾来源的293T细胞中，靶向EGFR基因（在很多胶质母细胞瘤中高表达，且常位于ecDNA上）的上下游区域，制造DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs），诱导断裂的两端重新连接（end-joining），从而成功地在这些细胞中生成了含有EGFR基因的环状ecDNA（ecDNA+细胞）。

为了确认这些环状DNA确实是游离的ecDNA，而不是染色体上串联重复（tandem duplications）产生的假象，研究人员进行了一系列验证。他们通过FISH (Fluorescence in situ hybridization)技术观察了细胞分裂中期的图像。在野生型U251细胞中，EGFR基因的信号与代表7号染色体的CEN7信号是共定位的，都在染色体上。但在新生成的ecDNA+ U251细胞中，EGFR信号明显与7号染色体分离，并且在细胞核中形成了游离的焦点（foci），数量显著高于ecDNA-细胞（P = 0.000096）。这直接证明了EGFR基因已经从染色体上脱离，形成了ecDNA。在另一种ecDNA模型——来自同一患者的结直肠癌细胞系COLO320DM（ecDNA上MYC基因扩增）和COLO320HSR（染色体上MYC基因扩增）中，也观察到了类似的结果。

ecDNA既然能在细胞里“作妖”，就必须能自我复制。研究人员使用EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)——一种可以标记新生DNA的分子，通过EdU-FISH方法进行检测。他们在U251 ecDNA+细胞中看到了EdU信号与EGFR FISH信号的共定位，这清晰地表明，ecDNA正在这些细胞中积极地进行复制。COLO320DM细胞也显示了类似的复制能力。

更令人惊讶的是，这些ecDNA在细胞内可以相当稳定地存在。通过qPCR检测，研究人员发现在构建的U251和293T ecDNA+细胞模型中，相对EGFR拷贝数在长达60天的培养过程中都保持稳定，甚至略有增加。尽管这些模型中单个细胞携带的ecDNA数量可能低于体内肿瘤细胞，但这种稳定性已经足以支持对其维持机制的研究。

能自我复制的“脱缰野马”？ecDNA的顽强生存术

ecDNA既然能稳定存在并复制，那么细胞是如何维持它们的呢？这背后必然有复杂的分子机制在运作。研究人员采用了EdU-labeled immunoprecipitation (EdU-IP)结合Mass Spectrometry (MS)的方法，来“钓取”与新生DNA相关联的蛋白质。简单来说，就是在细胞合成新DNA时用EdU标记，然后将这些被标记的DNA连带与它们结合的蛋白质一起“拉”出来，再用质谱仪鉴定这些蛋白质。

结果发现，这个方法成功富集到了很多已知与DNA复制相关的蛋白质，证实了其有效性。更重要的是，在ecDNA+细胞中，有大量蛋白质显著富集，其中不仅包括了MCM2和POLD等DNA复制关键蛋白，提示ecDNA+细胞的DNA复制活动更旺盛，还鉴定出了在所有三种ecDNA+细胞系（U251